milipore超濾管的正確使用問題

一、蛋白在濃縮時(shí)出現(xiàn)了沉淀，如何改進(jìn)？

蛋白如果濃縮過快或者過度濃縮都有可能引起蛋白沉淀。建議蛋白濃縮后的最終濃度不超過20mg/ml。對于對濃縮速度敏感而容易沉淀的蛋白，建議的改進(jìn)方法是：

1）離心力降為推薦離心力的30%-50%

2）改用截留分子量更大的超濾管（如原本選用10k，此時(shí)可以選擇30k） 

3）在濃縮過程中取出超濾管，用槍頭反復(fù)吹吸幾次后再繼續(xù)濃縮

4）體積較大的樣品可考慮選用攪拌式超濾杯，減少沉淀的發(fā)生。

二、Amicon® Ultra超濾管可以用酒精消毒滅菌么？

Amicon® Ultra與70%乙醇是兼容的，但是對滅菌處理的具體方法沒有做相關(guān)的測試，所以無法提供更進(jìn)一步的參考信息。建議采用Ultrafree無菌離心管對濃縮后的樣品進(jìn)行過濾除菌。

三、Amicon® Ultra超濾裝置是否可以用于高壓滅菌？

Amicon® Ultra都是采用熱封設(shè)計(jì)，不可以用高壓高溫滅菌。

四、懷疑濃縮過程中目的蛋白和超濾膜之間可能存在非特異性吸附，如何改善？ 

Amicon® Ultra超濾管使用的是再生纖維素膜，這種材質(zhì)是蛋白吸附zui低的超濾膜。但是對于一些疏水性蛋白或非極性蛋白，它們和膜的非特異吸附可能會(huì)增強(qiáng)。對于這種情況，可以嘗試在實(shí)驗(yàn)前對超濾管進(jìn)行封閉處理，也可以嘗試換成Amicon® Ultra 0.5或2來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過減小膜面積來降低非特異性吸附。

五、有時(shí)候用超濾離心管連水都離不下來，可能是什么原因？

Amicon® Ultra超濾膜中含有微量甘油。如果出現(xiàn)這種情況，請先用0.1 N NaOH清洗再離心。最后用緩沖液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應(yīng)立即使用，如暫時(shí)不用，請保持潤濕狀態(tài)，避免重新干燥。

六、如果要用超濾的方法分離兩種蛋白，那么這兩個(gè)蛋白的大小需要相差多少？

按照經(jīng)驗(yàn)，建議兩個(gè)蛋白的分子量要相差一個(gè)數(shù)量級（10倍）。

七、說明書中推薦在室溫下進(jìn)行離心，考慮到蛋白的穩(wěn)定性，是否可以在4℃進(jìn)行離心？

可以，但是低溫會(huì)增加蛋白樣品的粘性，導(dǎo)致流速減慢，建議可將離心時(shí)間延長到原來的1.5倍。

八、濃縮后發(fā)現(xiàn)濃縮液中沒有目的蛋白，可能的原因有哪些？

首先，Amicon® Ultra超濾管的蛋白zui低起始濃度為25ug/ml。請確保樣本的起始濃度大于這個(gè)濃度。其次，如果問題仍然出現(xiàn)，請不要丟棄樣本濾過液以便用于分析可能的原因：

1）如果目的樣本在濾過液中，那么請排查：

  a） 是否選擇了合適截留分子量的超濾管（目的蛋白分子量的1/2或者1/3）？

  b）使用的離心力是否是在限定范圍內(nèi)？如果使用的是rpm，請換算成相應(yīng)的g離心力，具體換算方法請垂詢。

  c）離心機(jī)最近是否有校準(zhǔn)過？

  d）是否shou次嘗試這個(gè)蛋白？如果能確保用同樣的超濾管對其它蛋白成功操作的話，那么有可能是這個(gè)目的蛋白的原因。有時(shí)蛋白會(huì)因其本身的一些特性（構(gòu)象差異）而影響濃縮效果，建議選用更小截留分子量的超濾管（如原本選用30k，此時(shí)可以選擇10k）

2）如果目的樣本也不在濾過液中，那么：

  a）蛋白樣本起始濃度是否大于25ug/mL？

  b）用來確定樣本濃度的方法是什么？是否可信？

  c）目的蛋白是不是沉淀了？如果是，具體解決方法請參考上面的關(guān)于蛋白沉淀問題的解釋。

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