怎么提高質粒超螺旋比例

一、質粒

質粒是一種環狀的小分子 DNA，是進行 DNA 重組的常用載體，在分子生物學研究和基因治療中對于質粒的產量和質量都有一定的要求，其中超螺旋比例和內毒素含量是影響質粒質量的兩個重要因素。

雖然超螺旋通常是主要形式，但在所有質粒制備中，切口和線性DNA形式通常作為次要形式回收。

但是，如果操作不當的話，超螺旋形式的DNA質粒的收獲率可能不高，那么如何提高質粒DNA的超螺旋比例呢？

二、提高質粒超螺旋比例的方法

（1）在生長平臺期收獲細菌培養物

在對數生長過程中過早收獲細菌時，經常會看到帶切口的 DNA。為避免分離出大量帶切口的DNA，建議收獲進入生長平臺期（生長12-16小時后）的細菌。

（2）不要渦旋和輕輕移液

如果在質粒分離過程中將制備物渦旋或過度劇烈搖晃，則可能會因DNA的機械剪切而出現切口或線性DNA。所以建議輕輕混合，不要渦旋，輕輕少量地移液。

（3）切勿過度使用堿性裂解液

堿性裂解是從基因組DNA中分離質粒DNA關鍵步驟，但如果過度使用，則可能通過將質粒長久變性為單鏈環狀形式來長久破壞質粒的超螺旋。所以建議將裂解的孵育時間保持在推薦的時間，并在此步驟中非常輕柔地混合。

（4）小心處理質粒重懸液

風干后質粒重懸期間可能會發生剪切。質粒越大，發生剪切的可能性就越大。沉淀后輕柔處理制備物，讓DNA吸收到水中，而不是劇烈吹打。

（5）避免核酸內切酶

某些細菌菌株含有核酸內切酶A（endA+），可以線性化DNA。建議將質粒轉化到endA–菌株中，則盡可能高效地進行質粒制備，以快速將DNA從酶中移開。

（6）保持低溫

有研究表明在較低溫度（4-12°C）下執行所有步驟會增加回收的超螺旋質粒的量

三、舉例

如圖所示，質粒提取之后進行瓊脂糖凝膠電泳，開環質粒的占比約20%，說明超螺旋比例低，一般超螺旋比例需要＞90%，一般來說超螺旋比例越高，質粒的穩定性越高，高超螺旋比例的質粒在轉染效率、基因表達水平等方面具有更好的表現。

原因：裂解時間不宜過長，加入裂解液后裂解時間不應超過5分鐘，以免質粒受到破壞

解決方法：優化裂解時間；確保質粒的結合和所有溶液都在室溫下進行，減少離心力對質粒超螺旋結構的影響，因為過度的離心可能會破壞質粒的超螺旋結構。

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