如何區(qū)分染色體DNA和質粒 DNA

一、前言

在質粒提取中，其原理是基于生物大分子在物理和化學性質上的差異，通過變性、復性、沉淀和純化等實驗步驟進行區(qū)分、提取。蛋白質在堿性環(huán)境下容易發(fā)生變性，使用 SDS (十二烷基*)等去垢劑破壞細胞膜時，SDS 與蛋白質發(fā)生變性，形成復合物，使其沉淀；RNA 通常會加入 RNase 降解 RNA，但一般 RNase 的加入時間通常在細菌/細胞裂解之后、質粒 DNA 純化之前，以確保 RNA 被充分降解；最關鍵的問題是: 如何將染色體 DNA 和質粒 DNA 區(qū)分出來？

二、如何區(qū)分染色體DNA和質粒DNA

細菌沒有細胞核，只有一個擬核(nucleoid)，而染色體 DNA 是環(huán)狀的，但并非裸露的，上面結合有多種 NAPs(nucleoid-associated proteins)。NAPs 和基因轉錄活性可以改變擬核的形態(tài)結構。這樣的話，質粒 DNA 就要簡單很多，游離于細胞質中，以共價閉環(huán) cccDNA(convalently closed circular DNA)的形態(tài)存在。

在強堿和 SDS 的條件下，染色體 DNA會被降解成線性片段并發(fā)生變性。當加入中和液(如醋酸鈉)后，染色體 DNA 雖然會復性，但無法恢復其原始的雙鏈結構，而是形成一團纏繞在一起無法溶解的網狀結構，通過高速離心，這些變性的染色體 DNA 會與 SDS-protein 復合物一起沉淀到管底，從而與質粒 DNA 分離；然后在強堿環(huán)境下，質粒 DNA雖然也發(fā)生一定程度的變性，但其兩條互補鏈仍會緊密盤繞在一起，保持雙鏈結構，加入中和液后，質粒 DNA 能夠迅速復性，恢復其天然的雙鏈結構，并以溶液狀態(tài)存在于上清液中，通過后續(xù)純化步驟(過柱或磁珠吸附)，可以進一步獲得高純度的質粒 DNA。

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