細胞傳代的實驗步驟是什么？有何注意事項？

在細胞培養過程中，去除原培養基并將細胞從原培養體系轉移到新鮮的培養基中，維持細胞的活力與增殖。細胞傳代既可以擴大細胞培養量，也能夠避免細胞因進入平臺期而出現生長抑制甚至死亡的情況。那么你知道細胞傳代的實驗步驟是什么嗎？有何注意事項呢？讓我們一起來看看吧！

一、實驗步驟

1. 貼壁細胞的傳代:

1) 倒置顯微鏡下觀察細胞形態及密度，評估細胞的狀態，以作為傳代比例的參考。

2) 提前紫外殺菌（至少30min為宜）操作臺及實驗材料。

3) 注意無菌操作，在操作臺中吸除或倒掉培養皿內舊培養液（盡可能去除干凈，鈣離子、鎂離子和血清蛋白的存在會降低胰酶活力）。

4) 加入適量PBS緩沖液洗滌1~2次。

5) 加入1~2 mL胰酶（以全部覆蓋細胞為準），輕輕晃動培養皿，使胰酶充分接觸細胞（建議：胰酶分裝成適量，提前水浴復溫到37℃）。

6) 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞，當細胞變圓且大多數細胞脫落時，表明此時細胞消化適度（加入胰酶后，邊計時邊顯微鏡下觀察，記錄細胞消化的時間，供今后細胞消化參考）

7) 加入2~3 mL 含血清完quan培養液（也可以考慮使用該細胞本次的培養上清），終止消化，輕柔吹打，使細胞完quan脫落。

8) 收集細胞懸液，轉移至離心管中，1500 rpm 離心5 min（必要時可以考慮，低速、短時間的離心有助于去除細胞碎片、細菌污染等）。

9) 棄去上清液，加入適量體積含血清培養液，重懸細胞，根據細胞生長速度、是否有密度依賴性及計劃傳代的時間等特點，按照比例將細胞懸液分裝入2個或多個無菌培養皿/培養瓶內，培養皿內可預先加入適量培養基。注意細胞充分混勻，保證細胞均勻分布。 

2. 懸浮細胞的傳代：可通過離心收集后用含血清的培養基直接傳代。

二、注意事項

1. 嚴格無菌操作！

2. 適度消化：提前復溫胰酶37℃以及消化計時，易保證消化過程穩定。消化時間過長，容易影響細胞狀態及活性，消化時間過短易多細胞成團，影響實驗效果。

3.吹打過程要輕柔，避免細胞液的灑濺。

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